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  近年来，微流体技术已被认为是一种强大的工具，可以在与细胞直径相当的尺度上操作细胞或流体。迄今为止，各种新型微流控分离器已被报道，其中一些已成功商业化。根据所采用的工作原理，报道的微流控分离器可分为主动和被动两类。主动微流控分离器通常利用外场(如磁场、电场、光学场、声场)对细胞施加外力。分离能够最终靠将不同的细胞移动到不同的位置或在特定位置捕获目标细胞来实现。由于施加在细胞上的外力可以精确调节，因此主动微流控分离器能轻松实现较高的操作精度。然而，由于外界的力的作用时间的延迟，这些活性分离器的处理处理量通常很低，这阻碍了这些活性分离器在处理大流体中的应用。

  同时，被动式微流控分离器利用流体效应或特定微结构诱导的流体动力实现细胞分离这一类的代表性技术有惯性微流体、粘弹性微流体、确定性侧向位移、流体动力过滤、挤压流分馏等。由于被动微流控分离器具有较高的通量，已大范围的应用于从复杂细胞群中分离稀有细胞。

  在这项工作中，我们开发了界面弹性惯性微流体，用于高通量和高纯度分离恶性胸膜和腹膜积液中的MTCs。成功地将我们的装置应用于五种不同癌症患者的临床胸腔和腹膜积液中MTCs的分离。

  图1A显示了我们的界面弹性惯性微流控装置的示意图，该装置由三个入口(即两个样品入口和一个护套入口)，一个直主通道和三个出口(即两个废物出口和一个目标出口)组成。含有不同大小细胞的样品流体通过两侧样品入口泵入装置，粘弹性流体作为鞘液，通过中间鞘入口注入装置。

  通过控制样品流体和护套流体的流速，使三种流体同时共流过主通道，在彼此之间形成稳定的流体界面。图1B显示了细胞的迁移过程以及细胞在通道上的力竞争。由于细胞最初被限制在靠近通道壁的样品流中，由壁效应引起的惯性升力(FL)将使细胞侧向移动到中间的鞘液中(图1B中的I)。当细胞靠近流体界面时，由细胞表面的压弹性应力不对称引起的界面弹性升力(FE)将迫使细胞向通道壁移动(图1B中的II)。FL和FE都非常大程度上依赖于细胞的大小，因此大细胞将受到强大的力，并能够穿过流体界面进入中间鞘液。

  当进入粘弹性流体(中护套流体)时，由于来自近壁侧的压弹性应力的偏移作用，有限元方向发生了逆转(图1B中的III)。当接近通道中心线时，由于剪切梯度效应的支配，FL的方向发生逆转。最后，占主导地位的FE (FE FL)将迫使大细胞向通道中心线B中的IV)。因此，大细胞可以聚焦在通道中心线上。同时，小细胞仍被流体界面拦截，保留在原始的样品流体中。利用这一原理，大的MTCs集中在通道中心线上，能够最终靠中间靶出口收集，而小的血细胞(白细胞和红细胞)通过两侧的废物出口去除，使得高纯度的MTCs以高通量的方式从背景血细胞中分离出来。

  图1C展示了5 μm、10 μm和15 μm颗粒混合物的器件分离原理。在出口，15 μm的颗粒集中在通道中心线 μm的小颗粒分离良好，验证了该装置的有效性。整个分离过程是完全被动的，设备能通过简单地控制样品和鞘液的流速来操作，而无需预先标记细胞。

  图1 (A)用于从背景血细胞(白细胞和红细胞)中高通量、高纯度分离MTCs的界面弹性-惯性微流控装置示意图。(B)细胞的迁移过程和细胞在通道上的竞争力。由于对称，只展示了一半的横截面。(C)用5 μm、10 μm和15 μm的颗粒混合物演示设备分离原理。给出了入口和出口附近的颗粒分布。其中红条表示15 μm颗粒的分布，蓝条表示5 μm和10 μm颗粒的分布。

  我们的器件由三层组成，包括一个上盖层#1，一个中间通道层#2和一个底盖层#3(见图2A)。上盖层1由通孔组成，通孔作为进、出口，中间通道层2包含通道图案。采用厚度为50 μm的聚硅氧烷薄膜材料作为中间通道2层，采用聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜作为1号和3号两个覆盖层。如图2B所示，这三层的图案使用AutoCAD软件(Autodesk)进行设计，并使用UV激光切割机进行切割。切割后，除去通道和孔中的材料，形成薄膜中的通槽。然后，用氧等离子清洗剂(PDC-002, Harrick plasma)处理这三层，并粘合在一起，形成聚合物薄膜芯片。这三层的对齐是在每层的角落定位孔和在定制夹具中定位销的帮助下完成的。图2C为总厚度小于300 μm的器件照片。更重要的是，我们的设备材料成本非常低，整个制造过程可以在10分钟内完成。低成本和快速制造使我们的设备在未来大规模生产和一次性使用。图2D显示了制备通道的显微镜图像。制作完成后，将器件夹在两块PMMA板之间，如图2E所示。

  图2 (A)各层CAD设计。(B)示意图说明了我们的设备使用激光切割和粘接的制造过程。(C)制造装置的照片。通道完全用红色墨水填充，以便清晰地显示。(D)显微镜图像说明制造通道。(E)组装后的设备照片。PMMA板作为样品导入和出口的芯片接口。

  我们首先探索了流速比对颗粒分离的影响。将5 μm、10 μm和15 μm颗粒悬浮液分别以160 μL min−1的总流量泵入装置。护套与样品的流量比分别控制在0.25、0.5、1和2。图3A为不同流量比下出口系统前5 μm、10 μm和15 μm颗粒的分布情况。

  从这些图像中可以清楚地观察到，在所有测试的流量比下，只有15 μm大的颗粒才能穿过流体界面进入中间护套流体并在通道中心线处聚集成流。

  同时，由于惯性升力相对较弱，5 μm和10 μm的小颗粒仍然被限制在靠近两个通道侧壁的原始样品流体中。颗粒分布位置的差异有利于15 μm大颗粒与5 μm和10 μm小颗粒的成功分离。与5 μm颗粒的带状聚焦不同，10 μm颗粒能够在原始样品流体中形成两条聚焦流。

  我们还绘制了流速比(R)为0.25和1时通道宽度上的荧光强度图(见图3B和图C)。从这两幅图中我们发现，随着流速比的增加，5 μm和10 μm小颗粒的两个聚焦带/流被推向通道侧壁，这有利于5 μm和10 μm小颗粒的完全去除。

  因此，为了高效分离具有多分散尺寸的细胞，最好选择大于1的R。然而，R的增加会降低样品流体的实际处理吞吐量。因此，确定下游实验R为1。

  图3 流量比对颗粒分离的影响。(A)流量比为0.25、0.5、1和2时，出口系统前5 μm、10 μm和15 μm颗粒的分布图像。黄色虚线 μm的颗粒分别进行红、蓝、绿伪着色。(B和C)在流速比(R)为0.25 (B)和1 (C)时，通道宽度上的荧光强度。在子图a中白色虚线处测量荧光强度，强度归一化。红色、蓝色、绿色分别代表5 μm、10 μm和15 μm的颗粒。

  将血液稀释100倍，分别以104个/ mL的浓度将3种肿瘤细胞(A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞)加入稀释后的血液中，以总流量240μL min- 1、流量比为1的方式注入装置。图4A显示了入口附近、主通道和出口附近的细胞分布的明亮和荧光图像。在进口处，试样-护套-试样形成了明显的共流动。当沿通道迁移时，大的肿瘤细胞迁移到中间的鞘液中，而小的血细胞仍然被限制在原始的样本液中。通过三分支出口系统，肿瘤细胞可以从血细胞中分离出来，并通过中间目标出口收集。

  为了定量评价本装置的分离性能，对从目标和废物出口收集的液体进行了分析。以血细胞、肿瘤细胞回收率、肿瘤细胞纯度为指标评价分离效果。血细胞去除率的定义是将废物中的血细胞数量除以初始样本中的血细胞总数。肿瘤细胞的回收率由从目标出口收集的液体中的肿瘤细胞数除以初始样品中的肿瘤细胞数来计算。分离的肿瘤细胞的纯度由目标肿瘤细胞的数量除以从目标出口收集的液体中的细胞总数来确定。图4B-D显示了添加了三种肿瘤细胞的样品计算出的血细胞去除率、回收率和纯度。A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞加标样品的血细胞去除率分别为99.85%±0.03%、99.83%±0.02%和99.86%±0.03%。A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞的回收率分别为94.31%±2.03%、94.65%±2.75%和93.28%±2.35%。此外，分离得到的A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞的纯度分别为40.99%±2.78%、38.20%±2.53%和42.55%±1.48%。结果发现，使用我们的装置可以稳定地达到99.8%以上的高血细胞去除率，而这三种样品的肿瘤细胞平均回收率和纯度分别高达94%和40%。

  图4 细胞分离性能表征。(A)明亮和荧光图像显示了靠近入口、主通道和靠近出口的细胞分布。黄色虚线表示通道壁。肿瘤细胞被染色，然后加入稀释后的血液样本中。荧光图像中的荧光流显示染色肿瘤细胞的运动轨迹。(B - D)计算三种肿瘤细胞(A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞)加标样品的血细胞去除率(B)、回收率(C)和纯度(D)。

  为了检验我们的设备在临床样本中的实际应用，我们使用我们的设备从临床胸膜和腹膜积液中分离MTCs。收集5种不同癌症(胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肝癌和肺癌)患者的胸膜和腹膜积液。制备好的样品经滤网过滤去除较大杂质后，以总流量240 μL min−1、流量比为1泵入装置。

  图5A为显微镜图像，显示了出口的细胞分布。可以清楚地观察到，大细胞迁移到中间鞘液中，能够最终靠中间靶出口(II)收集，而大部分小细胞被两侧废物出口(I和III)清除。由于很难直接识别图5A中的MTCs，我们从三个出口(I、II和III)收集液体。

  图5B显示了收集到的液体的照片。观察到两侧废物出口的液体呈现出胸膜和腹膜积液的原始颜色，而中间靶出口的液体呈现出较浅的颜色。我们进一步分析了从中间靶出口收集的液体(II)。使用免疫荧光染色技术区分靶MTCs和残余白细胞。满足CK+、CD45−和DAPI+标准的细胞被识别为MTCs，满足CK−、CD45+和DAPI+标准的细胞被识别为wbc。图5C为在亮场模式下从出口II采集的液体的取样显微图像。图5D为免疫荧光染色后的荧光图像。在采样窗口中可以清晰地观察到罕见的MTCs。

  然而，仍有一些大尺寸的白细胞也能穿过流体界面进入中鞘液。不能从相似大小的白细胞中分离出MTCs是依赖于粒度的分离技术的固有限制。为了进一步解决这一限制，我们的设备可以与其他尺寸无关的分离技术(例如，免疫磁分离)耦合。更有趣的是，我们得知使用我们的设备成功恢复了完整的MTCs集群。

  图5 临床胸膜和腹膜积液中MTCs的分离。(A)显微镜图像显示出口的细胞分布。(B)从三个出口(I, II和III)收集的液体照片。(C)从出口II在亮场模式下的液体显微镜图像。(D)免疫荧光染色后的荧光图像。满足CK+、CD45−和DAPI+标准的细胞被识别为MTCs，满足CK−、CD45+和DAPI+标准的细胞被识别为wbc。红色箭头表示mtc，白色箭头表示白细胞。

  在这项工作中，我们开发了界面弹性惯性微流体，用于高通量和高纯度分离恶性胸膜和腹膜积液中的MTCs。该装置由低成本聚合物薄膜制成，采用快速激光切割和粘合工艺。

  利用透明质酸作为弹性增强剂，可获得比以往界面弹性惯性微流体高得多的通量。我们首先探索了关键操作参数(即流量比和流量)对颗粒分离的影响。有趣的是，使用我们的装置能实现大流速下稳定的颗粒分离。接下来，个人会使用加入不同浓度肿瘤细胞(A549、MCF-7和MDA-MB-231细胞)的血液样本来表征设备的分离性能。在120 μL min−1的高样品通量下，血液细胞去除率达99.8%以上，肿瘤细胞平均回收率达94%，肿瘤细胞平均纯度高达40%。最后，我们成功地将该装置应用于不同癌症患者临床胸腔和腹膜积液中MTCs的分离。我们的工作可能为胸膜和腹膜积液的细胞学诊断提供一个潜在的样品制备工具。

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